개요
올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)(이하 '올리고')를 화학적으로 합성하는 원리에 대해 설명한 포스팅
이번 포스팅에서는 PCR, DNA sequencing, Single Nucleotide Polymorphism (SNP) 등 분자생물학 실험에서 자주 써먹는 올리고가 어떤 화학적 원리로 합성되는지 확인해보겠습니다.
대부분의 올리고는 phosphoramidite를 재료로 하여 자동화된 합성기에서 합성됩니다.
포스포아미다이트(phosphoramidite)를 이용한 올리고의 화학적 합성은 무려 30년 전에 소개된 방법입니다.
이 방법은 DNA phosphoramidite nucleoside를 기반으로 하여 만들어진 방법입니다.
재료
여기서 DNA phosphoramidite nucleoside는 5’-OH 부분이 4,4’-dimethoxytrityl (DMTr) 등 여러 보호기(protecting group)로 치환된 것을 사용합니다.
각 염기별로 주로 사용되는 클래식한 phosphoramidite는 benzoyl-dA, benzoyl-dC, iso-butyryl-dG and dT입니다.
dN 앞에 붙은 것이 보호기라고 생각하시면 되고, dT의 경우 보호 따윈 필요 없는 강한 놈입니다.
꼭 위의 네 개만 사용하는 것은 아니고, 합성법이나 합성 장비 등 여러 상황에 따라 acetyl-dC, dimethylformamidine-dG 같은 다양한 phosphoramidite가 사용됩니다.
합성기에서의 올리고 합성
올리고 합성 과정을 보시면 아시겠지만 사실상 단순 반복에 가깝기 때문에, 기계로 대체될 수 있는 반복적인 부분은 모조리 합성기(synthesizer)가 대신 수행하고 있습니다. 사람은 합성기를 다룰 수 있기만 하면 됩니다.
합성기에서의 합성은 액체 상태의 시약들이 주기적이고 반복적으로 분사되며 이루어지므로, 올리고가 한 군데서 안정적으로 합성되려면 고체 상태의 지지대(support)가 필요합니다. 이러한 지지대를 보통 학술적으로는 solid support라고 말하며, 이 solid support에 주로 사용되는 재료는 CPG(controlled-pore glass)와 polystyrene 두 가지 입니다. (출처)
이 재료가 포함된 컬럼(column)에서 원하는 디자인의 올리고가 합성됩니다.
올리고 합성 과정 4단계와 원리
올리고 합성 사이클은 크게 4단계로 이루어 집니다.
1) Deblocking (detritylation)
2) Activation / Coupling
3) Capping
4) Oxidation
합성기를 이용한 합성은 3'에서 5' 방향으로 진행되는데, DNA polymerase의 합성 방향과는 반대인 것이 특징입니다.
합성의 시작은 합성될 서열 첫 번째 염기의 3' 부분이 column의 CPG나 polystylene와 결합·고정 되면서 시작합니다.
그 다음 합성 사이클 첫 번째 단계인 Deblocking 단계로 이동하게 됩니다.
이 단계는 Detritylation이라고도 하는데, 결합된 첫 번째 염기의 5'부분을 5'-OH로 활성화 시키기 위해 5’-dimethoxytrityl group를 제거해주는 과정이 핵심이기 때문입니다.
이 때, 산(acid)도가 있는 시약을 취해주는데, 일반적으로 DCM(Dichloromethane)이라는 용매에 3% trichloroacetic acid가 들어간 시약을 사용합니다.
이렇게 첫 번째 합성된 염기의 DMT기가 제거되며, 다음 과정으로 넘어가게 됩니다.
이제는 두 번째 염기를 첫 번째 합성된 염기와 연결(coupling)해 주는 과정으로 넘어가게 되는데, 이때 염기를 바로 쏴주지 않고 염기들이 잘 coupling 될 수 있도록 column 내 환경을 조성해주는 작업이 선행됩니다. ETT나 BTT와 같은 tetrazole 계열의 시약이 여기에 사용됩니다. (출처)
이 과정을 Activation이라고 하며, 바로 다음 염기를 분사해주고 incubation 과정을 거쳐 염기 사이의 coupling이 진행됩니다.
이러한 CPG나 polystyrene 기반의 phosphoramidite 기반의 coupling 과정은 99%의 efficiency를 보여줍니다.
그렇다면 나머지 1% 정도의 coupling 과정이 진행되지 않은 녀석들에 대한 문제가 생깁니다. 이녀석들이 column에 계속 존재하는 이상 원하지 않는 서열이 계속 합성될 가능성이 있기 때문이죠.
이렇게 원하지 않게 합성된 애들(unwanted side-product)의 싹을 잘라버리기 위해 수행하는 작업이 capping 단계 입니다.
이 단계에서는 n+1번째 염기와 coupling 과정이 진행되지 않은 n번째 염기의 5'-OH를 아세틸기를 붙여 산화시켜 버립니다.
여기서 사용되는 시약의 주성분은 크게 두 가지 인데, acetic anhydride와 catalyst N-methylimidazole 입니다.
실무에서는 Cap A, Cap B 이런식으로 간단하게 표현합니다.
다음으로는 합성 사이클의 마지막 단계인 Oxidation 단계로 넘어갑니다.
n+1과 n 염기 사이의 trivalent phosphite triester 부분이 화학적으로 불안정하기 때문에, 이 부분을 산화시켜주어
pentavalent phosphotriester의 형태로 안정화시켜주는 과정입니다.
이 과정에서 사용되는 시약은 iodine이 포함된 THF/(pyridine or lutidine)/water 등이 사용됩니다.
이러한 일련의 합성 과정이 1사이클을 이루고, 우리가 원하는 서열이 만들어질 때까지 반복됩니다.
그렇게 우리가 원하는 서열의 마지막 염기까지 합성되면, 마지막 염기의 5'-DMTr에서 DMT를 떼어낼 것인지를 끝으로 합성기의 작동은 종료됩니다. 마지막 염기의 DMT를 ON할 것인지 OFF할 것인지는 사전에 합성기 작동자가 결정합니다.
합성 이후 과정
이제는 지지체였던 CPG나 polystrene으로부터 합성된 올리고를 떼내는 과정만이 남았습니다.
이 합성된 올리고를 solid phase로부터 떼내는 과정을 cleavage라고 합니다.
이 때 사용되는 시약은 대표적으로 상온(room temperature)의 ammonium hydroxide solution이 있습니다.
여기서 원한다면 합성 조건과 환경에 따라, deprotection 또한 cleavage와 동시에 진행 가능합니다.
실무에서는 통상 이 과정이 같이 진행되는데, ammonium hydroxide solution을 이용하여 당-인산(sugar-phosphate) backbone의 시아노에틸기(cyanoethyl group)를 제거하고 각종 보호기들을 제거합니다.
Deprotection 과정 이후에는 각종 부산물 제거를 위한 탈염(de-salted) 과정과 정제(purification)가 남아 있습니다.
정제 방법에는 여러 가지가 있는데, Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE), reverse-phase (RP) HPLC, cartridge methods, ion-exchange (IE) HPLC 등이 있습니다.
여담으로 합성간 마지막에 DMTr 보호기를 남겨두는 것이 정제 과정까지를 고려했을 때 선호되는 방법입니다.
시중에 판매되는 정제 카트리지 kit나 역상 크로마토그래피(RP HPLC)의 경우, 마지막 hydrophobic한 DMTr의 성질을 이용하여 정제를 하는 원리이기 때문입니다.
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